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  分子影像学杂志  2014, Vol. 37 Issue (1): 11-13  DOI: 10.3969/j.issn.1674-4500.2014.01.03
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引用本文 

陶振超, 邱俊, 钱立庭, 王明明, 吴爱东 . 6MV-X射线对肝癌细胞周期进程的影响[J]. 分子影像学杂志, 2014, 37(1): 11-13. DOI: 10.3969/j.issn.1674-4500.2014.01.03

基金项目

安徽省卫生厅医学科研重点项目(2010A004)

作者简介

陶振超,硕士,住院医师,E-mail: taozhenchao@sina.com

通信作者

钱立庭,E-mail: money2004@sina.com

文章历史

收稿日期:2013-11-28
6MV-X射线对肝癌细胞周期进程的影响
陶振超1, 邱俊2, 钱立庭1, 王明明3, 吴爱东1     
1 安徽省肿瘤医院放疗科,安徽 合肥 230001;
2 安徽省第二人民医院影像科,安徽 合肥 230022;
3 安徽医科大学核医学教研室,安徽 合肥 230032
摘要目的 研究人肝癌细胞对6MV-X线放射敏感性与细胞周期进程间的联系。 方法 用流式细胞术检测4Gy 6MV-X线照射后不同时间以及不同剂量HepG2和PLC/PRF/5两种细胞的细胞周期分布状况。 结果 4Gy 6MV-X线照射后24 h,HepG2细胞凋亡率高于PLC/PRF/5细胞,分别为(7.61±0.77)%和(5.63±0.87)%(P<0.05),且随时间和剂量增加,差异越显著;HepG2细胞受4 Gy照射后12 h,G0/G1比例下降,后逐渐上升,G2/M期比例增高,随后逐渐下降,0~6 Gy照射24 h后,G0/G1期比例逐渐上升,G2/M期比例逐渐下降;PLC/PRF/5 细胞G2/M期比例随照射后时间延长及照射剂量增加而增高,G2 期阻滞更为明显。 结论 HepG2细胞对放射更为敏感,0~6 Gy 6MV-X线照射可以改变HepG2与PLC/PRF/5细胞周期进程,HepG2细胞发生G1和G2期阻滞,PLC/PRF/5发生G2期阻滞。
关键词: X线     HepG2细胞     PLC/PRF/5细胞     细胞周期     肝癌    

早年,人们对肝癌细胞(hepatoma carcinoma cell,HCC)的放射敏感性缺乏足够的认识。Zeng等[1]从放射生物学角度验证了HCC的放射敏感性几乎等同于鼻咽低分化鳞癌,与分化差的上皮细胞相近,仅次于骨髓、淋巴组织和肾。然而,经临床观察,放疗剂量达到50~60 Gy之间,肿瘤有效率达到76%,仍有部分不敏感。同时也观察到,低分化鳞癌(如鼻咽癌)经过6~7 周的放疗后,肿瘤大部分缩小,而肝细胞癌缩小不明显,需放疗结束后1.5个月或更长时间[2]才明显缩小或消失。为研究不同肝癌细胞对X射线敏感性差异与细胞周期进程间的联系,我们选择两种不同的肝癌细胞,进行了下述实验。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

人肝癌细胞HepG2(P53野生型)由安徽医科大学核医学教研室馈赠;人肝癌细胞PLC/PRF/5(P53 突变型)购自上海细胞库。DMEM培养基购自GIBCO公司,新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。HepG2 和PLC/PRF/5 细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基中。放置于37 ℃ 、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。 每3~4 d传代1次。

1.2 照射条件

加速器为senergy(瑞典医科达医疗系统公司)。照射条件:6MV-X射线;照射野:40 cm×40 cm;剂量率200 MU/min(1 MU=1 cGy);机架角:180°;源皮距:100 cm。 射线投射率~100%。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡和周期

将两种肝癌细胞数调至3×105/ml,按1 ml/孔接种于6 孔培养板培养24 h 细胞贴壁后,分别予2、4、6 Gy 6MV-X照射。48 h 后收集细胞(其中4 Gy组收集12、 24、48 h细胞),PBS液洗涤2次,漩涡振荡器上缓慢加入预冷70%乙醇200 μl,混匀,4 ℃ 固定过夜。离心弃上清,PBS洗涤2 遍(1500 r/min×5 min/次),加入PBS液 300 μl 重悬细胞,再加RNaseA(25 mg/ml)20 μl,37 ℃ 30 min,再加50 μg/ml碘化丙啶(PI)40 μl染色,4 ℃避光30 min上流式细胞仪检测。

1.4 统计分析

所得数据表示为均数±标准差,采用SPSS 13.0软件进行统计分析。各组之间进行两独立样本t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 受4Gy X射线照射后不同时间HepG2、PLC/PRF/5 细胞凋亡状况

照射后24、48 h组,两种肝癌细胞凋亡率均明显增加,且HepG2 细胞凋亡较PLC/PRF/5 细胞更为明显 (表 1)。

表1 4 Gy X射线照射后不同时间细胞凋亡状况
2.2 受不同剂量X射线照射后24 h HepG2、PLC/PRF/5 细胞凋亡状况

随着照射剂量的增加,两种肝癌细胞凋亡率均明显增加,4、6 Gy组HepG2细胞凋亡较PLC/PRF/5细胞更为明显(表 2)。

表2 不同剂量X射线照射后24 h 细胞周期分布状况
2.3 受4Gy X射线照射后不同时间HepG2、PLC/PRF/5 细胞周期分布状况

照射后12 h HepG2细胞G2/M期比例较空白组增高,随后逐渐下降,S期比例于12 h升高明显,24、48 h与空白组相比无明显差异;而在PLC/PRF/5细胞组中,G2/ M期比例随照射后时间的延长逐渐增高,S期比例逐渐降低(表 3)。

表3 4 Gy X射线照射后不同时间细胞周期分布状况
2.4 受不同剂量X射线照射后24 h HepG2、PLC/PRF/5 细胞周期分布状况

2 Gy X线照射后24 h,HepG2细胞S期比例增加,4 Gy组与空白组相比无明显差异,G2/M期比例逐渐下降,6 Gy组G0/G1期比例明显上升;在PLC/PRF/5细胞组中,随着照射剂量的增加,S期比例逐渐降低,G2/M 期比例逐渐增高(表 4)。

表4 不同剂量X射线照射后24 h 细胞周期分布状况
3 讨论

众所周知,电离辐射作用后的细胞存活状况与凋亡水平和细胞周期进程是密切相关的。辐射可以导致 DNA碱基损伤,诱导细胞凋亡,但辐射诱导细胞凋亡是一个多因素、多层次的复杂系统,故不同细胞受辐照后凋亡水平有很大区别。辐射同时可以改变细胞周期的进程,通过启动细胞周期关键点的信号转导通路,使细胞阻滞于G1、S、G2/M期,进行损伤后修复[3]。然而不同肿瘤细胞对电离辐射的敏感性有所差异,辐射启动细胞周期关键点的信号转到通路不同,导致经放射后细胞周期的阻滞时相和阻滞程度也不尽相同。

本研究显示,6-MV X线照射两种人肝癌细胞4 Gy 后24 h,HepG2 细胞的凋亡率即开始高于PLC/PRF/5 细胞,分别为(7.61±0.77)%和(5.63±0.87)%,两者差异有统计学意义(P<0.05),随着放射后时间的延长以及辐射剂量的增加,人肝癌HepG2和PLC/PRF/5细胞的凋亡率均逐渐上升,并且两种细胞凋亡率的差异逐渐增大,提示HepG2细胞较PLC/PRF/5细胞对放射更为敏感。

随后,我们又对辐射后的两种细胞周期进行分析,发现4 Gy照射后12 h HepG2细胞G2/M期比例较空白组增高,但随照射后时间及照射剂量的增加而减小,说明HepG2 接受4 Gy照射后12 h,细胞发生G2/M期阻滞,随后阻滞“崩溃”,细胞被释放,即细胞阻滞解除,再度进入细胞周期或死亡,而在PLC/PRF/5细胞组中,G2/ M期比例随照射后时间的延长逐渐增高,至第48 h才逐渐下降。G2/M期阻滞可使受损细胞亚致死损伤得以修复,对不能修复的损伤则通过诱导细胞凋亡,以去除受损伤的细胞[4]。而PLC/PRF/5细胞G2/M期阻滞时间较 HepG2细胞延长,导致受照射细胞不能进入分裂周期,为癌细胞的DNA损伤提供更多的修复时间,也延缓了未能修复的DNA因分裂导致分裂性死亡,最终使肿瘤消退时间增加。因此,缩短辐射所致的G2/M期阻滞,理论上有可能促进肿瘤细胞的分化和凋亡。

另外,在HepG2细胞接受6 Gy照射后,我们观察到 G0/G1 期比例明显上升,而PLC/PRF/5 细胞并未发生 G1期阻滞,这可能与p53基因存在状态有关。G1期阻滞与细胞凋亡明显相关,而哺乳动物细胞中野生型p53 蛋白在G1/S期过渡中期关键作用[5],是目前公认的G1 期阻滞核心调控分子。G1期阻滞仅在野生型p53基因存在时出现[6-9]。研究[10-14]表明野生型p53蛋白可通过其内源性和外源性途径参与细胞周期调控,阻止细胞从 G1 期进入S 期,对细胞分裂与增殖起负调节作用,纠正p53缺陷或促进其表达是肿瘤基因治疗的一种有效方法。

综上所述,不同的肝癌细胞经电离辐射后,细胞凋亡和周期阻滞并不完全相同,这可能是造成临床观察肿瘤细胞退缩时间差异的又一因素,也是临床中个案针对性的放射治疗计划往往难以实现的一个重要原因。

参考文献
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